具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）基序的轉(zhuǎn)錄因子（TF）通過激活或抑制不同靶基因的表達，在神經(jīng)祖細胞（NPC）向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的命運決定中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白3（NPAS3）屬于TFs的bHLH PAS超家族，研究表明，攜帶bHLH結(jié)構(gòu)域缺失的NPAS3缺陷小鼠顯示成年海馬神經(jīng)發(fā)生和認知行為缺陷。星形膠質(zhì)細胞功能障礙通過影響鄰近神經(jīng)元功能而誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，在皮質(zhì)發(fā)育過程中星形膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元通信如何調(diào)節(jié)復(fù)雜行為仍然未知，且調(diào)節(jié)NPC向星形膠質(zhì)細胞分化的bHLH因子也未被研究。

2022年，8月30日，中科院北京生命科學(xué)學(xué)院孫中生與王彥課題組在cell reports上發(fā)文揭示bHLH因子（NPAS3）缺陷將損害皮質(zhì)星形細胞生成并誘導(dǎo)自閉癥樣行為。

首先，課題組通過免疫染色發(fā)現(xiàn)Npas3缺陷導(dǎo)致小鼠發(fā)育過程中皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞生成減少。而對成年鼠的大腦評估顯示：Npas3+/-鼠的大腦重量和寬度及皮質(zhì)長度顯著增加，表現(xiàn)出大頭畸形。結(jié)構(gòu)性磁共振結(jié)果顯示Npas3+/-鼠的腦脊液、扣帶皮層、胼胝體和藍斑區(qū)域體積顯著增加；此外，體素分析結(jié)果顯示其腦脊液體積增加，而由星形膠質(zhì)細胞驅(qū)動的白質(zhì)體積減少。

圖1|Npas3+/-鼠腦部結(jié)構(gòu)異常

隨后，課題組對兩組小鼠進行行為學(xué)測試，結(jié)果顯示：Npas3+/-鼠在社交測試階段對物體和陌生鼠的探索時間沒有差異，在社交新穎性測試階段對陌生鼠和熟悉鼠的探索時間沒有差異，即表現(xiàn)出社交及社交新穎性缺陷；而在超聲波發(fā)聲實驗中，Npas3+/-幼崽在P7（出生后7天）和P13與母鼠分離時發(fā)出的呼叫較少，呼叫持續(xù)時間較短；此外，Npas3+/-的自我梳理時間也顯著增加，表現(xiàn)出焦慮樣表型。這些結(jié)果表明Npas3缺陷導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生ASD樣行為。

圖2|小鼠行為學(xué)測試結(jié)果

為了確定NPAS3在星形膠質(zhì)細胞發(fā)生初期誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，課題組在P0期對WT和NPAS3+/-小鼠皮層進行了RNA測序，并發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)細胞生成和突觸調(diào)控有關(guān)的基因表達水平下調(diào)；高爾基染色結(jié)果顯示Npas3+/-皮質(zhì)II/III層錐體神經(jīng)元基底樹突棘密度顯著降低，而透射電鏡的結(jié)果顯示Npas3+/-小鼠皮層中突觸后致密區(qū)PSD）的不對稱突觸的數(shù)量顯著減少，其PSD長度也顯著減少。體外培養(yǎng)實驗顯示：NPAS3缺陷的星形膠質(zhì)細胞將減少與之共培養(yǎng)的神經(jīng)元數(shù)量。這些結(jié)果表明星形膠質(zhì)細胞的異常發(fā)生影響了星形膠質(zhì)細胞-突觸的相互作用。

圖3| 體外共培養(yǎng)實驗結(jié)果

進一步的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，Npas3缺陷將擾亂小鼠腦中放射狀膠質(zhì)細胞到星形膠質(zhì)細胞的正常分化，從而顯著降低星形膠質(zhì)細胞的生成。ChIP測序數(shù)據(jù)的分析表明NPAS3 的結(jié)合靶點廣泛覆蓋了星形膠質(zhì)細胞形成的各個過程，并涉及大腦發(fā)育、樹突發(fā)育和突觸形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。最后，課題組采用化學(xué)遺傳的方法在WT鼠的星形膠質(zhì)細胞中特異性敲低NPAS3，發(fā)現(xiàn)這些小鼠同樣表現(xiàn)出自閉癥樣相關(guān)的形態(tài)和行為異常。

圖4|NPAS3影響樹突發(fā)育和星形膠質(zhì)細胞對突觸形成的控制

總的來說，該文發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子——NPAS3調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞分化以及星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元通訊過程，且NPAS3缺陷會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞生成異常并引發(fā)自閉癥樣行為。這項研究為bHLH轉(zhuǎn)錄因子在星形膠質(zhì)細胞生成中的缺陷如何影響皮質(zhì)發(fā)育和復(fù)雜行為的機制提供了見解。