趨化因子CCL19對小鼠 認知及情緒樣行為的影響

摘要

情緒和認知是上等神經精神活動的重要內容，其功能研究是腦科學研 究的重要部分。免yi系統參與調節中qu神經系統的思維活動，其機制錯綜復雜，其中亦包括免yi細胞以及免yi分子如細胞因子等對中qu神經系統功 能的調節作用。并且，神經精神ji病與免yi系統炎癥密切相關，可表現為 臨床上常見的中qu神經系統ji病與免yi系統的“共病”現象，包括慢性炎 癥與抑郁癥“共病”，艾滋病與癡呆癥“共病”的現象等。其中免yi系統的 細胞因子以及趨化因子是導致該“共病”現象的重要活性分子，發揮對認 知功能相關ji病如阿爾茨海默病，以及情緒障礙相關ji病如焦慮癥、抑郁 癥等ji病的重要調節作用。

聯體結合模型（Parabiosis)通過血管吻合術將兩只小鼠腹部縫合在一 起，使兩只小鼠共用一套血液循環系統。近年來，該模型被廣泛應用于衰老領域的研究，是研究免yi分子對中qu神經系統功能影響的重要模型。2011 年斯坦福大學Tony Wyss-Coray教授課題組為研究免yi微環境對機體衰老 的影響，采用聯體結合模型，篩選出6個系統因子（Systemic factor)在這 一過程中發揮重要作用，包括 CCL2 (MCP-1)、CCLll(Eotaxin)、CCL12 (MCP-5)、CCL19 (MIP-3p)、p2M(p2 microglobulin)、觸珠蛋白（Haptoglobin)。 這六個系統因子中，CCL2及CCL12對中qu神經系統的功能的調節作用己 有較多報道，CCL2水平升高與認知功能損傷程度呈正相關，CCL12與低氧 誘導的神經炎癥關系密切。該團隊隨后研究表明，CCL11、p2M可抑制小鼠 海馬區的神經發生，導致小鼠學習記憶能力下降；側腦室注射CCL11中和 抗體可顯著改善CCL11對小鼠海馬區神經發生的抑制作用，恢復小鼠空間 學習記憶能力，而敲除P2M基因亦可改善上述損傷。

趨化因子CCL19是在聯體結合模型基礎上篩選出的6個系統因子之 一。它屬于趨化因子CC家族，其受體為CCR7。在免yi系統中，CCL19 主要由中性粒細胞、巨噬細胞等分泌，其受體主要表達在T淋ba細胞、B 淋ba細胞、DC細胞表面。CCL19通過與CCR7受體結合趨化T淋ba細胞、 B淋ba細胞、DC細胞迀移至病灶區域發揮作用。此外，CCL19/CCR7軸亦 對T淋ba細胞的歸巢及存活發揮重要作用。近年來研究表明，大腦的星形 膠質細胞以及腦血管內皮細胞皆可分泌趨化因子CCL19，在中qu神經系統 炎癥時，趨化免yi細胞進入中qu神經系統，到達病灶區域。中qu神經系統 炎癥反應亦伴隨著血漿中CCL19表達水平的異常，例如多發性硬化癥、腦 缺血性損傷、神經炎癥ji病的患者，其血液和腦脊液中趨化因子CCL19的 表達水平皆異常升高。CCL19受體CCR7可表達于海馬、胼胝體區域的星 形膠質細胞，然而其對星形膠質細胞功能的影響尚不清楚。CCR7基因敲除 的小鼠表現為學習記憶能力的損傷，以及抑郁及焦慮樣情緒障礙。以上研 究提示趨化因子CCL19/CCR7對中qu神經系統的作用不可忽視。情緒和認 知是*為重要的兩類腦上等神經精神功能，但是，目前報道趨化因子CCL19 對情緒以及認知功能的影響尚不明確。

本課題以正常小鼠以及長期不可預期性慢性應激模型小鼠為研究對 象，研究趨化因子CCL19對小鼠認知樣行為以及情緒樣行為的影響。并從 免yi系統功能和神經系統功能兩個方面，研究趨化因子CCL19對認知或情 緒樣行為影響的機制。

**部分趨化因子CCL19對正常小鼠認知及情緒樣行為的影響 1.趨化因子CCL19對正常小鼠認知樣行為的影響

選取2-3月齡C57BL/6小鼠，分別側腦室單次注射CCL19 (0.05 jig)以及隔天腹腔注射CCL19 (10pg/kg)，注射共12次歷時35天。通過六臂

水迷宮實驗，觀察CCL19對小鼠空間學習記憶能力的影響；通過新物體識 別實驗，觀察CCL19對小鼠物體識別記憶能力的影響。結果表明，趨化因子CCL19單次側腦室注射和腹腔注射12次，均對小鼠在六臂水迷宮實驗 中的錯誤數，新物體識別實驗中物體辨識指數無顯著影響，提示趨化因子 CCL19對小鼠的認知樣行為無顯著影響。趨化因子CCL19對正常小鼠情緒樣行為的影響

采用上述給yao方式，通過高架0型迷宮實驗和糖水消耗實驗，觀察趨 化因子CCL19對小鼠焦慮及抑郁樣情緒的影響。結果表明，趨化因子CCL19 顯著增加了小鼠的糖水消耗率，減少了小鼠在高架0型迷宮中開放臂的停 留時間。以上實驗結果提示，趨化因子CCL19可能對小鼠的焦慮及抑郁樣 行為有明顯影響。趨化因子CCL19、CCL21中和抗體對小鼠焦慮及抑郁樣行為的影響

趨化因子CCL21是趨化因子CCL19的共受體因子，可以與CCR7結合 發揮對免yi細胞的趨化作用。CCL21對焦慮及抑郁樣行為的作用亦不明確。 因此，本部分實驗旨在進一步確認CCL19及CCL21對焦慮及抑郁樣行為的 影響，并采用CCL19及CCL21中和抗體研究CCL19及CCL21對情緒反應 的作用。

選用2-3月齡C57BL/6小鼠，分為五組，分別為正常組(腹腔注射PBS)， CCL19組，CCL21組，CCL19中和抗體組，CCL21中和抗體組。隔天腹腔 注射CCL19、CCL21 (均為10 |ig/kg)，注射共12次歷時35天。第30天 時，分別側腦室注射CCL19、CCL21 (均為0.05|ig)中和抗體及同型對照 抗體（正常組及CCL19、CCL21處理組注射同型對照抗體0.05|ig)。第36 天進行行為學實驗。通過高架十字迷宮以及曠場實驗評價小鼠的焦慮樣行 為，通過糖水消耗實驗以及強迫游泳實驗評價小鼠的抑郁樣行為。結果表 明，各處理組小鼠的自主活動性均無顯著性差異。CCL19腹腔注射顯著增 加小鼠的糖水消耗率，降低小鼠在強迫游泳實驗中的不動時間，對小鼠在 高架十字迷宮中的開放臂停留時間以及曠場實驗的中間區域運動時間無顯 著影響。提示CCL19對小鼠抑郁樣行為有顯著影響，對小鼠焦慮樣行為無 明顯影響。CCL21腹腔注射顯著增加小鼠糖水消耗率，對小鼠在強迫游泳 實驗中的不動時間、曠場實驗的中間區域運動時間及高架十字迷宮的開放 臂停留時間無顯著影響。提示CCL21對小鼠焦慮及抑郁樣行為均無明顯影 響。

側腦室注射趨化因子CCL19以及CCL21中和抗體后觀察小鼠的抑郁和 焦慮樣行為，結果表明小鼠在上述各行為學實驗中的表現與同型對照抗體注射組小鼠表現無顯著差異，提示側腦室注射CCL19、CCL21中和抗體對 CCL19及CCL21的情緒相關作用無顯著影響。

第二部分趨化因子CCL19對長期不可預期性慢性應激小鼠抑郁及焦慮樣 行為的影響

在確定CCL19對正常小鼠的抑郁樣行為有顯著影響的基礎上，采用長 期不可預期性慢性應激（CUMS)模型，評價趨化因子CCL19對CUMS模型小鼠焦慮樣及抑郁樣行為的影響。實驗分五組，分別為正常組（腹腔注 射PBS)，CUMS模型組（腹腔注射PBS)，陽**氟西汀給藥組（10mg/kg)， CCL19 組（10|ig/kg)，CCL19 與氟西汀合用組（10|ig/kg+10mg/kg)。隔天 腹腔注射CCL19,注射共12次歷時35天。第25天至第35天，每天腹腔 注射氟西汀，給藥共10次。造模持續35天，于第36天進行行為學實驗。

釆用自主活動實驗評價趨化因子CCL19對CUMS模型小鼠的自主活動 性的影響。結果表明，CUMS造模顯著降低小鼠體重，氟西汀及趨化因子CCL19腹腔注射可以在造模后期（第22天至第24天）緩解小鼠體重的下 降。各處理組小鼠的自主活動性均無顯著性差異。